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超氧化物歧化酶（Superoxide Dismutase,  SOD）試劑盒說明書（WST-8法）

                                                分光光度法50管/48樣 天津本生

正式測定務(wù)必取2-3個預(yù)期差異較大的樣本做預(yù)測定                                            

測定意義：

SOD（EC  1.15.1.1）廣泛存在于動物、植物、微生物和培養(yǎng)細胞中，催化超氧化物陰離子發(fā)生岐化作用，生成H2O2和O2。SOD不僅是超氧化物陰離子清除酶，也是H2O2主要生成酶，在生物抗氧化系統(tǒng)中具有重要作用。

測定原理：

通過huangpl及huangpl氧化酶反應(yīng)系統(tǒng)產(chǎn)生超氧陰離子(O2-.)，O2-.可與WST-8反應(yīng)產(chǎn)生水溶性染料甲臜，后者在450nm處有吸收；SOD可清除O2-.，從而抑制了甲臜的形成；反應(yīng)液黃色越深，說明SOD活性愈低，反之活性越高。

組成：

自備儀器和用品：

分光光度計、離心機、移液器、1ml玻璃比色皿、研缽、冰和蒸餾水

粗酶液提取：

1、細菌、細胞或組織樣品的制備：

細菌或培養(yǎng)細胞：先收集細菌或細胞到離心管內(nèi)，離心后棄上清；按照細菌或細胞數(shù)量（104個）：提取液體積（ml）為500~1000：1的比例（建議500萬細菌或細胞加入1ml提取液），超聲波破碎細菌或細胞（冰浴，功率20％或200W，超聲3s，間隔10s，重復(fù)30次）；8000g  4℃離心10min，取上清，置冰上待測。

組織：按照組織質(zhì)量（g）：提取液體積(ml)為1：5~10的比例（建議稱取約0.1g組織，加入1ml提取液），進行冰浴勻漿。8000g  4℃離心10min，取上清，置冰上待測。

2、血清（漿）樣品：直接檢測。

測定步驟：

1、 分光光度計預(yù)熱30min以上，調(diào)節(jié)波長至450nm，蒸餾水調(diào)零。

2、 試劑三的稀釋：將試劑三用蒸餾水稀釋50倍，用多少配多少。（試劑三和蒸餾水1：49稀釋。

3、  工作液配制：在試劑一加入250μl試劑二，充分混勻。配好的試劑4℃避光可保存一周。（若一次性測定樣本較少，可按照實際用量將試劑一和試劑二按照20ml：0.1ml的比例混勻配制）

4、 將一瓶試劑四用5ml蒸餾水溶解（溶解后一周內(nèi)用完）。

5、 樣本測定（在1ml玻璃比色皿中依次加入下列試劑）

充分混勻，室溫靜置30min后，450nm處測定各管吸光值A(chǔ)。

注意事項:

1、試劑三為酶，不可冷凍，使用時在冰上放置。

2、對照管只需要做一管。

3、SOD為什么有的樣本測定管大于對照管，對照管數(shù)值在什么范圍？

對照管的范圍是0.8-2。對照管吸光值過低可能是（1）試劑三活性低，可以適當減少稀釋倍數(shù)；（2)沒有按順序加試劑；（3）反應(yīng)時間不夠，可以延長反應(yīng)時間（反應(yīng)時間30min可以延長到40min）。對照管吸光值過高可能是試劑三未按操作說明書稀釋相應(yīng)倍數(shù)。

若出現(xiàn)測定管大于對照管，可能是樣本中雜質(zhì)的影響太大，為了降低雜質(zhì)的影響一般將樣本提取上清液用蒸餾水或提取液稀釋10倍后再測，通?？梢允箿y定正常。計算公式中乘以相應(yīng)稀釋倍數(shù)。

SOD活性計算：

1、抑制百分率的計算

抑制百分率＝(A對照管－A測定管) ÷A對照管× 100%

盡量使樣本的抑制百分率在10-90%范圍內(nèi)。如果計算出來的抑制百分率小于10%或大于90%，則通常需要調(diào)整加樣量后重新測定。如果測定出來的抑制百分率偏高，則需將樣本用提取液適當稀釋；如果測定出來的抑制百分率偏低，則需重新準備濃度比較高的待測樣本。

2、SOD酶活性單位：在上述huangpl氧化酶藕聯(lián)反應(yīng)體系中抑制百分率為50%時，反應(yīng)體系中的SOD酶活力定義為一個酶活力單位(U/ml)。

3、SOD酶活性計算：

（1）血清（漿）SOD活性(U/ml)=[抑制百分率÷(1－抑制百分率)×V反總]÷V樣=20×抑制百分率÷(1－抑制百分率)

（2）組織、細菌或培養(yǎng)細胞SOD活力計算：

a.按樣本蛋白濃度計算

SOD活性(U/mg prot)=[抑制百分率÷(1－抑制百分率)×V反總]÷(V樣×Cpr) =20×抑制百分率÷(1－抑制百分率)÷Cpr

需要另外測定，建議使用本公司BCA蛋白質(zhì)含量測定試劑盒。

b.按樣本鮮重計算

SOD活性(U/g 鮮重)=[抑制百分率÷(1－抑制百分率)×V反總]÷(W ×V樣÷V樣總)=20×抑制百分率÷(1－抑制百分率)÷W

c.按細菌或細胞個數(shù)計算

SOD活力(U/104 cell)=[抑制百分率÷(1－抑制百分率)  ×V反總]÷(500×V樣÷V樣總) =0.04×抑制百分率÷(1－抑制百分率)

V反總：反應(yīng)體系總體積，1ml；V樣：加入反應(yīng)體系中樣本體積，0.05ml；V樣總：加入提取液體積，1 ml；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/ml  ；W：樣本質(zhì)量，g；500：細胞或細菌總數(shù)，500萬。